干货：外泌体提取方法荟萃

如何获得你所想要的外泌体？              
     

外泌体提取方法荟萃：

外泌体（ Exosome）发现于 1986 年，是一种直径约 30~100nm 的双层膜囊泡状结构小体，
可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、 网织红细胞、 血小板、 神经细胞和
肿瘤细胞等主动分泌产生， 广泛分布于外周血、尿液、唾液、 乳汁、腹水、羊水等体液中。

外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的 mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能， 使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。

外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注什么？

外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。 据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、 超滤、 沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：
1、 超速离心法（差速离心）
超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（ 如图所示） ，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。
2、密度梯度离心
在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在 1.13-1.19g/ml
的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。
3、超滤离心
由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。
4、磁珠免疫法
外泌体表面有其特异性标记物（如 CD63、 CD9 蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受 pH 和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。
5、 PEG-base 沉淀法
聚乙二醇（ PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。 利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多（ 假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20 等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。
6、 试剂盒提取
近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。

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然而，市场上各类产品纯化效果良莠不齐，目前仍没有绝对的方法或试剂盒能满足所有要求，从各类样品中分离到理想的外泌体。

本文转至：外泌体exosome

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